Proyecto de investigación:
Caracterización molecular de genes de reparación de ADN y del daño generado por la luz solar en Bacillus Thuringiensis.

Nombre del investigador responsable:
Marcelo Barraza Salas
Área de conocimiento:
Ciencias de la vida
Disciplina:
Biología molecular
Fecha en que inicia el proyecto:
30 de septiembre, 2016
Fecha en que termina el proyecto:
29 de octubre, 2019
Tipo de financiamiento con que se realiza el proyecto:
Externo (otorgado por alguna institución distinta a la UJED).
Fuente de financiamiento:
CONACyT
Nombre de la convocatoria mediante la cual se obtuvo el apoyo (nombre, tipo y año).
Convocatoria 2015. CB-2015-01.

Información del protocolo

Protocolo

Cada año, las plagas de insectos causan pérdidas de entre el 15 y el 25% de la producción agrícola de todo el mundo. Las pérdidas en el rendimiento varían mucho entre los cultivos y las zonas geográficas, se han utilizado diversas estrategias para reducir o controlar estos daños agrícolas, la principal estrategia es el uso de insecticidas químicos. El uso indiscriminado a gran escala de productos no específicos, a menudo tóxicos para los mamíferos, aves y peces, ha dado lugar a la contaminación del medio ambiente, destrucción de organismos no blanco, y el desarrollo de resistencia a las plagas. A principios del siglo pasado surgió una nueva forma de combate de plagas con la ventaja de ser eficaz y no causar daños al medio ambiente, el control biológico, que se basa en el uso de enemigos naturales y sus productos para reducir las poblaciones de plagas. Los plaguicidas microbianos más ampliamente utilizados son los basados en las preparaciones de la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt.).

Bt., es una bacteria del suelo, anaerobia facultativa, móvil, perteneciente al grupo de bacterias Gram positivas, se caracteriza por su capacidad para producir inclusiones compuestas de una o más proteínas cristalinas (ICPs) que tienen actividad insecticida específica. Durante su ciclo de vida Bt presenta dos fases principales, la fase de crecimiento vegetativo en donde las bacterias se duplican por bipartición cada 30-90 min dependiendo del medio de cultivo y la fase de esporulación, un programa de diferenciación celular que tiene como objetivo la generación de una endospora.

Susceptibilidad de Bt. a la acción de factores ambientales. Los biopesticidas que contienen Bt. son ambientalmente amigables y efectivos en una variedad de situaciones, debido a la facilidad de su preparación es factible su uso hasta por pequeños agricultores. Su adecuado uso no produce riesgos para el aplicador, tampoco produce la mortandad de los insectos controladores. Sin embargo, una limitante muy importante para su aplicación en campo es, su rápida inactivación por exposición a la luz solar. La radiación ultravioleta (UV) es la principal responsable de esta inactivación debido a su impacto en las células por daño directo al DNA, por ejemplo la formación de dímeros de pirimidina, entrecruzamiento con proteínas o mediante la producción de especies reactivas de oxigeno derivados de radicales libres.

Uno de los modelos más estudiados para conocer los mecanismos implicados en la resistencia de las esporas a factores que causan daño al DNA es Bacillus subtilis (Bs), las esporas generadas por este organismo previenen o disminuyen dramáticamente el daño generado al DNA por el estrés oxidativo, luz UV, calor y desecación. Para remover los daños al DNA, las esporas de Bs. utilizan sistemas de reparación generales y específicos de espora como son la liasa del fotoproducto de espora (SplB), sistema de reparación por escisión de nucleótidos (UVR) y proteínas Rec. Además de estos sistemas de reparación, Bs. posee genes que codifican para una gran variedad de proteínas que ayudan a contrarrestar los efectos generados por factores ambientalmente relevantes como son, yqfS y exoA que codifica para AP endonucleasas las cuales eliminan los sitios apurinicos o apirimidicos del DNA mediante el sistema de reparación por escisión de bases (BER). Bs. cuenta también con una actividad de 8- oxo-dGTPasa gracias al gen ytkD cuyo producto cuenta con las propiedades necesarias para catalizar la hidrólisis de 8-oxo-dGT y 8-oxo-GTP. Esta actividad catalítica sugiere fuertemente que la proteína generada por este gen juega un papel fisiológico importante en contrarrestar el efecto mutagénico de estos nucleótidos oxidados. También se ha reportado una actividad de UV endonucleasa en Bs. codificada por el gen ywjD el cual protege a las esporas de los daños generados por la luz UV de tipo B. Otra actividad de uracil DNA glicosilasa ha sido reportada en Bs., esta es codificada por el gen ung el cual al ser inactivado mostró un ligero aumento en la frecuencia de mutación espontanea sin embargo, esta se vio incrementada al generar una doble mutante ung- YwqL un posible homólogo de una endonucleasa V, sugiriendo que ambos reducen el efecto mutagénico de la deaminación de bases.

Objetivo general

Establecer el papel bioquímico y fisiológico de posibles genes de reparación de ADN, así como el daño que genera la luz solar en células de Bacillus Thuringiensis Israelensis.

Objetivos específicos

  1. Identificación in silico de los genes de reparación de ADN de Bacillus thuringiensis israelensis: ung, nfo, exoA, ywjD, ytkD.

  2. Caracterización de la expresión de los genes ung, nfo, exoA, ywjD, ytkD de mediante fusiones con el gen reportero LacZ y análisis semicuantitativo de los ARN mensajeros durante el ciclo de vida de Bacillus thuringiensis israelensis.
  3. Clonación y generación de sistemas recombinantes para la expresión y purificación de los productos de los genes ung, nfo, exoA, ywjD, ytkD de Bacillus thuringiensis israelensis.

  4. Caracterizar bioquímicamente los productos de los genes ung, nfo, exoA, ywjD, ytkD de Bacillus thuringiensis israelensis.
  5. Obtención y caracterización fisiológica de cepas mutantes de Bacillus thuringiensis israelensis en cada uno de los genes en estudio con respecto al daño generado por la luz UV-B y UV-C.

Metas propuestas

  1. Adquisición del equipo de laboratorio solicitado.

  2. Asistentes de proyecto capacitados.

  3. Asignación de temas de tesis a los asistentes de proyecto.
  4. Asistentes de proyecto capacitados.
  5. Asignación de temas de tesis a los asistentes de proyecto inicio de escritura de artículo científico.
  6. Asistencia a foros científicos.

  7. Asistentes de proyectos graduados.

  8. Escritura de artículos científicos.

Fuente de la información

Dirección de Posgrado e Investigación


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